Arquivo de Avanços da Medicina





16 - jan

Terapia Gênica – Produção de insulina por engenharia genética

Categoria(s): Avanços da Medicina, Farmacologia e Farmácia

Terapia Gênica – Produção de insulina por engenharia genética

A glicose é uma das principais fontes de energia para nossas células, mas para as células do sistema nervoso, é a única fonte. Para essas células, ficar sem energia por tempo prolongado pode produzir danos severos e irreversíveis. Para garantir o bem estar e o bom funcionamento do organismo, como um todo, a glicemia deve ser mantida dentro de limites estáveis, o que se consegue através da interação entre ingestão de glicose, sua liberação de depósitos endógenos e a liberação de vários hormônios. Hormônios da família dos glicocorticóides, adrenalina, glucagon, hormônio de crescimento e a insulina participam da regulação dos níveis de glicose sérica.

Insulina

insulinaDentre os hormônios, o mais importante é, sem dúvida nenhuma, a insulina. A insulina é produzida pelas células beta, localizadas nas ilhotas de Langerhans, no interior do pâncreas, e tem a função de regular a quantidade de glicose existente no organismo.

A glicose penetra nas células graças à ação da insulina. No diabetes há falta de insulina e portanto a glicose não penetra nas células permanecendo na circulação. O nível normal de açúcar no sangue é de 70 a 110 mg/dL. Acima de 110 e até 126 mg fala-se em intolerância à glicose e após 126mg – diabetes mellitus.

Produção de insulina

Até alguns anos atrás a produção da insulina se dava pela extração de proteínas eucarióticas, requerendo grandes quantidades de matéria-prima (pâncreas suíno e bovino), que nem sempre estão disponíveis e são, geralmente, de elevado custo. Isso tornava o processo extrativo cada vez mais oneroso, além de ser uma proteína de origem animal, portanto diferente da humana, que causava grandes transtornos alérgicos. Nesse contexto, o emprego de técnicas mais eficientes, como a do DNA recombinante, abriu novas perspectivas de produção.

Características da molécula de insulina

A insulina tem sido isolada de uma grande variedade de espécies de vertebrados (o que permitiu a extração e uso em humanos da insulina dos suinos e buvinos), sendo que, em todas elas, a molécula é composta de duas cadeias polipeptídicas (A e B) ligadas por pontes dissulfídricas. A insulina humana, como muitos hormônios protéicos, é sintetizada como uma proteína precursora maior – cadeia de 110 aminoácidos, seguida de uma clivagem proteolítica, para gerar o hormônio ativo.

Os vinte e quatro primeiros aminoácidos formam o peptídeo sinal ou seqüência pré da proteína e têm a função de facilitar a entrada da mesma no retículo endoperiplasmático. Durante esse processo, o peptídeo sinal é separado da proteína, resultando na formação
da pró-insulina. Essa molécula resultante, na qual as cadeias A (21 aminoácidos) e B (30 aminoácidos) estão ligadas pelo peptídeo conectante C (35 aminoácidos), é a precursora da insulina. Ela adquire sua conformação com a formação de duas pontes
dissulfídricas e é transportada para o aparelho de Golgi, onde vai ser empacotada em grânulos de estoque.

Durante a formação e maturação dos grânulos secretórios, a pró-insulina é clivada por enzimas proteolíticas do tipo da tripsina,
resultando na liberação do peptídeo C.

Princípios da engenharia genética para insulina

Inicialmente construi-se um gene sintético para a pró-insulina humana a partir da sequência de aminoácidos dessa proteína descrita por Sures et al. (1980). Utilizando-se os códons genéticos preferenciais para Escherichia coli (De Boer & Katelein, 1986) para a otimização da expressão do gene nessa bactéria, foi montado um gene codificando a proteína humana. A partir deste novo DNA (DNA recombinante) pode-se então produzir a insulina humana, em grande quantidade e com menos carcaterísticas antigênicas, como mostra o esquema abaixo.

 

A Escherichia coli é uma bactéria bacilar Gram-negativa, que, juntamente com o Staphylococcus aureus é a mais comum e uma das mais antigas bactérias simbiontes do homem. O seu descobridor foi o alemão-austríaco Theodor Escherich, em 1885.

Referências:

Lima BD. A produção de insulina humana por Engenharia Genética Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 2001; 23:28-31. [on line]

Bell, G.I.; Swain, W.F.; Pictet, R.; Cordell,B.; Tischer, E. & Goodman, H.M.  Nucleotide sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin. Nature, 1979;282, 525-7.

Sures, I.; Goeddel, D.V.; Gray, A. & Ullrich, A. Nucleotide sequence of human preproinsulin complementary DNA. Science, 1980;208:57-9.

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15 - jan

Projeto Genoma Humano – Terapia Gênica: Como é feita.

Categoria(s): Avanços da Medicina, Conceitos, Genética médica

Terapia Gênica- Redesenhando os genes

O DNA humano contém aproximadamente 3,1 bilhões de pares de bases (A – adenina; G – guanina; C – citosina; T – timina) divididos em 20-25 mil genes. Após transcrita, a sequência de nucleotídeos de cada gene é traduzida em uma sequência polipeptídica, dando origem a uma proteína específica.

O genoma humano contém quase 10 milhões de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs - single nucleotide polymorphisms). No entanto, nem todo os SNPs são reconhecidos como funcionais, ou seja, nem todos têm potencial em afetar a expressão de um gene ou a função da proteína codificada por um gene mutante. Sendo assim, dentre as quase 10 milhões de variantes genéticas existentes, apenas uma parcela delas poderia influenciar um fenótipo específico. A tecnologia para a produção de proteínas por meio da manipulação de genes já é realidade.

A terapia gênica é caracterizada pela introdução de um material genético em células no sentido de graduar a funcionalidade de um gene ou substituir um gene não funcional. Esta estratégia foi desenvolvida e vem sendo aperfeiçoada com o propósito de prevenir, tratar ou aliviar os sintomas de doenças hereditárias ou desordens adquiridas. Basicamente, conhecer a via de sinalização na qual um gene está envolvido, identificar uma possível mutação neste gene e comprovar a disfunção causada pelo gene mutante são os passos iniciais que justificam a utilização da técnica. A terapia gênica pode ser realizada em linhagens de células germinativas ou somáticas. A introdução (knock in) ou deleção (knock out) de um gene exógeno em células germinativas resultará na propagação desta modificação para as novas células originárias. Já modificações através da introdução de um gene exógeno em células somáticas de um órgão ficariam restritas às células transfectadas.

METODOLOGIA DA TERAPIA GÊNICA

  1. Coleta-se células do paciente.
  2.  No laboratório modifica-se um vírus de forma que ele não se reproduza
  3. Introduz-se um determinado gen no vírus
  4. O vírus modificado se mescla com as células do paciente
  5. As células do paciente se modificam geneticamente
  6. As células modificadas são injetadas no paciente
  7. As células modificadas geneticamente produzem a proteína ou homônio desejado

 

Por motivos técnicos e éticos, a aplicação da terapia gênica em linhagens de células germinativas de seres humanos não é permitida. Por outro lado, a terapia gênica em células somáticas representa uma tecnologia promissora para a terapêutica de algumas doenças, mas ainda com poucos resultados positivos em estudos clínicos.

Aproximadamente 200 variantes em genes específicos foram identificadas até o momento e mostraram melhorar a performance física humana e a boa forma relacionada à saúde. A lista dos genes abaixo são indicativos dos quais poderiam ser transfectados ou bloqueados no genoma humano, visando a melhora na saúde das pessoas com deficiência física. Basicamente, a amplificação das capacidades físicas força/potência ou resistência pode ser alcançada com a modulação dos genes:

  1. Eritropoietina (EPO; cromossomo 7q22).
  2. Enzima conversora de angiotensina (ACE; cromossomo 17q23.3).
  3. Receptor ativado por proliferador de peroxissomo beta/delta (PPAR-β /δ; cromossomo 6p21.2-21.1).
  4. Coativadores transcricionais PGC-1α (PPARGC1A, cromossomo 4p15.1) e -1β (PPARGC1B, cromossomo 5q33.1).
  5. α -actinina 3 (ACTN3; cromossomo 11q13.1).
  6. Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, cromossomo 6p12).
  7. Fator de crescimento de fibroblasto (FGF, cromossomo 11q13.3).
  8. Fator de crescimento de hepatócito (HGF; cromossomo 7q21.1).
  9. Fator induzido por hipóxia 1α (HIF-1α ; cromossomo 14q21-q24).
  10. Fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1A; cromossomo 12q22-q23).
  11. Interleucina 3 (IL3; cromossomo 5q31.1).
  12. Miostatina (GDF8; cromossomo 2q32.2).
  13. Folistatina (FST; cromossomo 5q11.2).
  14. Hormônio do crescimento 1 (GH1; cromossomo 17q24.2)
  15. Fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK-C; cromossomo 20q13.31).

Referências:

Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 2004;431:931-45.

Rebbeck TR, Spitz M, Wu X. Assessing the function of genetic variants in candidate gene association studies. Nat Rev Genet 2004;5:589-97.

Alves GB, Oliveira EM, Alves CR, Rached HR, Mota GF, Pereira AC, et al. Influence of angiotensinogen and angiotensin-converting enzyme polymorphisms on cardiac hypertrophy and improvement on maximal aerobic capacity caused by exercise training. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil 2009;16:487-92.

Raper SE, Chirmule N, Lee FS, Wivel NA, Bagg A, Gao GP, et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab 2003;80:148-58.

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22 - nov

Sepse e Choque séptico – Avanços no entendimento da fisiopatogenia

Categoria(s): Avanços da Medicina, Bioquímica, Conceitos, Emergências, Inflamação

Sepse e Choque séptico – Avanços no entendimento da fisiopatogenia

A sepse e o choque séptico resultam de um resposta inflamatória exagerada do hospedeiro às várias agressões infecciosas, onde o microorganismos nem sempre detectados na corrente sanguínea dos pacientes. Estes fatos levaram os pesquisadores a constituir uma nova síndrome denominada síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SRIS). Esta síndrome em combinação com infecção define sepse e duas categorias adicionais, sepse grave e choque séptico. Somente, a partir de uma definição de consenso para a SIRS é que foi possível o avanço no estudo da fisiopatologia, evolução clínica e tratamento desta importante emergência médica.

O desenvolvimento da sepse é extremamente complexo sendo atribuído a uma predominância de resposta pró-inflamatória sistêmica exacerbada, em algumas pessoas, à um processo infeccioso, que em outras pessoas pode ser bastante símples. Esta  ampla ativação de células responsivas (macrófagos e neutrófilos) a componentes bacterianos resulta na liberação de vários mediadores inflamatórios como citocinas, quimiocinas, prostaglandinas, óxido nítrico e radicais livres de oxigênio que podem levar a dano mitocondrial e celular. Estes mediadores são também responsáveis por vasodilatação e liberação de moléculas de adesão que resultam em migração de neutrófilos e monócitos e ativação de linfócitos e celulas endoteliais. Há também a ativação da cascata de coagulação pelas citocinas e pelos próprios componentes bacterianos, que resulta em coagulação intravascular disseminada, shunts de microcirculação, hipoperfusão e piora da função celular pela hipóxia. E este conjunto de fatores que podem levar a falência orgância múltipla.

A descoberta de um grupo de receptores celulares de membrana conhecidos como Toll-like receptors (TLRs) que exercem a função de reconhecimentos das estruturas patogenicas das bactérias, de desencadeadores de sinalização inflamatória e de orquestradores da resposta imune, abriu novos caminhos nos tratamentos  baseados em modificação da resposta imunológica direcionado a seus mediadores, tais como moléculas de adesão, TNFa, interleucina-1, radicais livres de oxigênio, metabólitos do ácido aracdônico, fator de ativação plaquetária, óxido nítrico sintetase, dentre outros.

Todos os componentes do grupo Toll-like receptors (TLRs) são proteínas transmembrana que contém um domínio extracelular composto de 550-950 aminoácidos incluindo 18-31 repetições ricas em leucina, além de um domínio citoplasmático com aproximadamente 200 aminoácidos que são responsáveis por iniciar a resposta celular logo que o domínio extracelular reconhece seu ligante. O receptor de Interleucina-1 (IL-1) foi a primeira molécula descrita em mamíferos como tendo semelhança significativa do ponto de vista estrutural com a proteína Toll.

Lipopolissacarídeos bacterianos (LPSs) – As bactérias Gram-negativas possuem em sua parede externa moléculas de LPS, constituída por um lipídeo, um grupo de oligossacarídeos e uma cadeia de polissacarídeos que funciona como um antígeo específico da bactéria. Um grupo de receptores celulares de membrana conhecidos como Toll-like receptors (TLRs) exercem a função de reconhecimentos dessas estruturas patogenicas. A incapacidade das células da imunidade inata de um determinada pessoa em reconhecer LPS aumenta a possibilidade de invasão por bactérias gram negativas e morte do processo infeccioso. Por outro lado, uma resposta exuberante ao LPS resulta em liberação excessiva de mediadores inflamatórios responsáveis pelas alterações observadas na síndrome de resposta inflamatória sistêmica da sepse.

A figura a cima ilustra receptores CD14/TLR4/MD2.

Referências:

Beutler, B. Innate immunity: an overview. Mol Immunol 40, 845-59 (2004).

Janeway, C.A., Jr. & Medzhitov, R. Introduction: the role of innate immunity in the adaptive immune response. Semin Immunol 10, 349-50 (1998).

Bone RC. The pathogenesis of sepsis. Ann Intern Med 1991;115:457-69.

Karima R, Matsumoto S, Higashi H, Matsushima K. The molecular pathogenesis of endotoxic shock and organ failure. Mol Med Today 1999;5:123-32.

Saturnino SF. Mastócitos, Receptores tipo TOLL e Sepse: Manifestação de tolerância induzida por Lipopolissacárides como modelo para estudo de modulação de resposta inflamatória. Tese Unid Fed. Minas Gerais 2008 [on line]

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21 - nov

Dor no joelho – Cirurgia do ligamento

Categoria(s): Avanços da Medicina, Fisioterapia, Ortopedia geriátrica

Dor no joelho – Cirurgia dos ligamentos

Avanços da Medicina

 Idoso e festa

Observa-se que o segmento mais idoso da população brasileira sofreu um rápido aumento a partir dos anos 60, quando começou a crescer em ritmo bem mais acelerado do que as populações adultas e jovens. De 1970 até hoje, o peso da população idosa sobre a população total passou de 3% para 8% e esse percentual deve dobrar nos próximos vinte anos. Isto em virtude do aumento da expectativa de vida por ocasião do nascimento, que passou de 61,7 anos em 1980, para 69 anos nos dias atuais, a base da pirâmide populacional vem se estreitando nas últimas décadas. E existe ainda a expectativa de uma intensificação desse processo de envelhecimento populacional. Estima-se que a partir de meados do próximo século, a população brasileira com mais de 60 anos será maior que a de crianças e adolescentes com 14 anos ou menos.

O processo de envelhecimento traz consequências tanto para o desempenho físico dos indivíduos, como psicossocial, apresentando características como a diminuição da força, da capacidade aeróbia, da capacidade funcional, isolamento social, aumento da incidência de doenças crônico-degenerativas, etc. Assim, a prática de atividade física é um fator importante para retardar e diminuir os efeitos biológicos do envelhecimento. A prática de atividade física produz aumento da flexibilidade, da força muscular, colaborando para melhora da realização de atividades de rotina, e promovendo ganho na auto-estima, diminuição do risco de depressão e aumento da interação social, gerando melhora também nos fatores psicológicos do envelhecimento.

Apesar de todos os benefícios da prática de atividades físicas existe um risco de lesões, sobretudo quando se pratica atividades físicas competitivas. Uma das articulações mais atingidas são os joelhos, onde a rutura de ligamentos pode levar a graves consequencias, com dor e limitação dos movimentos. As cirurgias convencionais não são bem toleradas pelos idosos, sobre tudo nos que apresentam muitas patologias. O processo de reabilitação geralmente é longo e o pavor psicológico de nova queda produz um efeito do medo pós-trauma. A medicina buscando novos métodos terapêuticos apresenta um técnica pouco invasiva e emprego de materias altamente resistentes que permitem uma breve recuperação articular impedindo a atrofia muscular da perna afetada pela limitação dos movimentos.

Knee-T-Nol™  é uma prótese feita de filamentos super-elásticos de Nitinol. Isto proporciona a resistência mecânica necessária para a tensão, enquanto permite que a flexão e de torção. A utilização de ligas de Nitinol impede fenômenos comuns, tais como a fadiga, a deformação, que foram encontrados nos materiais anteriormente utilizados. O Nitinol é seguro e comprovado como uma liga implantável para uso médico. Os filamentos são fixados nas extremidades do fêmur e da tíbia, utilizando dispositivos de fixação padrão, tais como botões, alfinetes corticais cruzadas ou parafusos. Estes tipo de procedimento cirúrgico permite um  reduzido período de cicatrização e dor. Melhora cinética de reabilitação e resultado estético.

Referências:

CARVALHO, J. A. M.; GARCIA, R. A. O envelhecimento da população brasileira: um enfoque demográfico. Caderno de Saúde Pública, v.19. n. 3, p. 725-733, mai-jun/2003.

CONTE, E. M. T.; LOPES, A. S. Qualidade de vida e atividade física em mulheres idosas. Revista Brasileira de Ciências do Desenvolvimento Humano, Passo Fundo, p.65-75, jan./jun. 2005.

BENEDETTI, T. R. B. e col. Atividade física e estado de saúde mental de idosos. Revista de Saúde Pública, v. 42, n., p.302-307, 2008.

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20 - nov

Lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) – Doenças intestinais e reumáticas

Categoria(s): Avanços da Medicina, Biologia, Bioquímica, Conceitos, Farmacologia e Farmácia, Imunologia, Inflamação, Nutrição

Lipopolissacarídeos bacterianos (LPS)

 As doenças crônicas intestinais, como retocolites, síndrome do intestino irritado, etc, com doenças reumáticas, fibromialgias, espondilite anquilosante, artrite reumatóide têm componentes inflamatórios que possuem”gatilhos” (triggers) inflamatórios desencadeados por bactérias gram-negativas, vírus (ex. citomegalovírus). Um destes gatilhos é o lipopolissacarídeos bacterianos da bactérias Gram-negativa e outro são os peptidoglicanos e ácido lipoteicóico das bactérias Gram-positivas.

As bactérias Gram-negativas possuem em sua parede externa moléculas de LPS, constituída por um lipídeo, um grupo de oligossacarídeos e uma cadeia de polissacarídeos que funciona como um antígeo específico da bactéria. Um grupo de receptores celulares de membrana conhecidos como Toll-like receptors (TLRs) exercem a função de reconhecimentos dessas estruturas patogenicas.

Os PLSs das bactérias gram-negativa agem como uma endotoxina que se liga a um complexo de receptores CD14/TLR4/MD2 promovendo a interação entre proteínas intracelulas resultando na ativação do NFkB (nuclear factor kappa B), que migra para o núcleo das células de defesa e estimula a transcrição de genes que codificam para citocinas pró-inflamatória especialmente dos macrófagos, principalmente Interleucina 1(IL-1) e Fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa).

* Proteína CD14 – Cluster of differentiation 14 – Componente genético do sistema imune inato.

 Os monócitos, os neutrófilos, as células endotelias e os adipócitos, possuem receptores TLR4 com grande afinidade aos LPS, assim podemos entender como as bacterias gram-negativa podem estimular processo inflamatórios no vasos sanguíneos e células gordurosas, causando vasculites e distúrbios como artrite reumatóide e fibromialgia.

Veja o vídeo com a estrutura tridimencional do Toll-like receptors (TLRs)

 

 

ADENDO

De acordo com as suas estruturas das paredes celulares as bactérias podem ser coradas ou não pela técnica de coloração pelo corante de Gram (médico dinamarquês que idealizou esta técnica). A parede celular dos microrganismos gram-positivos (coloração azul) é uma estrutura relativamente simples, com espessura de 15 a 50 nm. Ela é composta de 50% de peptídeoglicanos, 40% a 45% de polímeros ácidos (o que resulta na superfície da célula ser polarizada e ter carga negativa) e 5% a 10% de proteínas e polissacarídeos.

A parede celular dos microrganismos gram-negativos (coloração vermelha) é muito mais complexa. Sendo constituída de 1. espaço periplasmático contendo enzimas; 2. camada de peptídeoglicanos; 3. membrana externa que consiste em uma dupla camada lipídica; 4. Polissacarídeos complexos que formam componentes importantes da superfície externa. Estes diferem entre as cepas de bactérias e são os principais determinantes antigênicos. A dificuldade em penetrar nesta camada externa complexa é a razão pela qual alguns antibióticos são menos ativos contra as bactérias gram-negativas (Ex. na Pseudomonas aeruginosa).

Referências:

Delves PJ, Roitt IM. The immune system. First of two parts. N Engl J Med 2000;343:37-49.

Medzhitov R, Janeway C.Jr. Innate immunity. N Engl J Med 2000;343:338-44.

Wright SD, Ramos RA, Tobias PS, Ulevitch RJ, Mathison JC. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science 1990;249:1431-3.

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